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本研究首先以黄瓜子叶法为基础,以化学药剂为材料,建立番茄灰霉病药剂筛选体系,分别从不同黄瓜品种、不同叶龄、不同菌龄、不同培养条件、不同施药方法等方面进行测试,针对灰霉病菌建立了简便、快速的杀菌剂生测方法。该体系可概括为:黄瓜选用对Botrytis cinerea Pers.中等感病品种长春密刺,叶龄为8 d左右,菌龄1 d的幼龄菌丝,喷雾法施药,0.5％水琼脂保湿,24℃光照培养,接种后24～36h测量结果。应用此法首先测试了4种化学药剂,2％恩泽霉水剂、25％菌思奇乳油、50％速克灵可湿性粉剂和40％施佳乐悬浮剂对番茄灰霉病的防治效果,检验了测试体系的稳定性,在此基础上,利用该体系从3株植物内生菌中筛选到一株对灰霉病菌有强烈抑制作用的菌株Eb-28菌株,该菌株由番茄茎分离获得。对Eb-28菌株培养条件的研究表明,培养温度、培养时间、培养基的酸碱度以及通气量对菌株生长都有影响,确定其最佳培养条件为:30℃下培养时间为48 h,初始pH值为6.0,通气量为175 mL/250 mL。采用常规方法结合分子生物学方法对Eb-28菌株进行了鉴定。根据Eb-28菌株的形态特征、培养性状以及生理生...更多化反应,结合伯杰氏细菌鉴定手册(第八版),初步将此菌株鉴定为芽孢杆菌属。16S rDNA序列分析表明Eb-28菌株的16S rDNA序列与枯草芽孢杆菌同源性为99％,最终鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。本研究表明,Eb-28菌株在离体叶片上对番茄灰霉病病斑扩展抑制率为51.68％。该菌株的发酵滤液对灰霉病菌抑菌圈直径达到20 mm以上,经121℃灭菌的滤液则无抑菌圈产生,说明发酵液中的活性成分在121℃灭菌后失活。显微观察发现,发酵液中活性物质可造成病原菌菌丝体原生质凝结,菌丝体畸形,不正常膨大。内生菌Eb-28菌株粗蛋白的提取采用NH42SO4分级盐析法,NH42SO4饱和度为60％时抑菌活性最高,抑菌圈直径达25 mm。且上清液无活性,可见活性物质均已被沉淀,为蛋白类物质。显微观察发现,抑菌圈周围受抑制菌丝畸形,原生质凝结,与发酵滤液对菌丝的影响一致。进一步研究发现,此粗蛋白抑菌活性在近中性至碱性条件下(pH值6.6～10.6)抑菌圈直径均达到20 mm以上,pH值在6.6以下粗蛋白抑菌活性显著降低。粗蛋白经40,60,80℃处理后,抑菌活性与4℃对照无显著差异,其抑菌圈直径均在20 mm以上。100℃处理20 min后粗蛋白抑菌活性与对照相比显著下降,抑菌圈直径为16 mm。经紫外线处理12 h后,抑菌活性与对照相同,抑菌圈直径均为21 mm。结果表明,粗蛋白在80℃以下有很好的热稳定性,在100℃时稳定性下降,且此粗蛋白在紫外光下稳定性良好。
番茄内生细菌Eb_28对番茄灰霉病菌抑制作用研究
摘要4-5
Abstract5-6
1 引言10-14
2 材料和方法14-22
2.1 供试材料14-15
2.1.1 供试菌株14
2.1.2 供试植物材料14
2.1.3 供试药剂14
2.1.4 试剂14
2.1.5 仪器14-15
2.2 番茄灰霉病药剂筛选生测体系的建立15-16
2.2.1 供试黄瓜品种15
2.2.2 不同菌龄B.cinerea致病力测定15
2.2.3 不同叶龄黄瓜子叶感病性的测定15
2.2.4 光、暗条件对黄瓜子叶感病性的影响15
2.2.5 黄瓜子叶正反面感病性的测定15
2.2.6 不同施药方法的测试15-16
2.2.7 番茄灰霉病生测体系的应用16
2.2.8 黄瓜子叶法与番茄离体叶片防效比较16
2.3 内生细菌Eb-28菌株生长条件的研究16-17
2.3.1 不同温度对Eb-28活菌数的影响16
2.3.2 通气量对Eb-28活菌数的影响16-17
2.3.3 pH值对Eb-28活菌数的影响17
2.3.4 培养时间对Eb-28活菌数的影响17
2.3.5 菌株Eb-28生长曲线测定17
2.4 内生细菌Eb-28菌株的鉴定17-20
2.4.1 生理生化特征17-19
2.4.2 分子鉴定19-20
2.5 内生细菌Eb-28菌株抑菌活性物质的初步研究20-21
2.5.1 Eb-28发酵滤液的制备20
2.5.2 抑菌物质生物活性测定方法20
2.5.3 Eb-28抗菌蛋白粗提液的制备及抗菌活性检测定20
2.5.4 Eb-28抗菌粗蛋白热稳定性测定20
2.5.5 Eb-28抗菌粗蛋白酸碱稳定性测定20
2.5.6 Eb-28抗菌粗蛋白对紫外线稳定性测定20-21
2.5.7 Eb-28纤维素酶活性测定21
2.5.8 Eb-28p-1,3-葡聚糖酶活性测定21
2.5.9 Eb-28蛋白酶活性测定21
2.6 数据分析21-22
3 结果和分析22-36
3.1 番茄灰霉病药剂筛选体系的建立及应用22-26
3.1.1 不同黄瓜品种对灰霉病感病性比较22
3.1.2 不同叶龄的黄瓜子叶感病性22-23
3.1.3 不同菌龄的番茄灰霉病菌致病力23-24
3.1.4 在不同光暗条件下黄瓜子叶对灰霉病的感病性24
3.1.5 黄瓜子叶正反面对灰霉病的感病性24
3.1.6 不同施药方法防治效果比较24-25
3.1.7 番茄灰霉病生测体系的应用25
3.1.8 黄瓜子叶法与番茄离体叶片防效比较25-26
3.2 内生拮抗细菌生长条件的研究26-28
3.2.1 温度对Eb-28活菌数的影响26
3.2.2 通气量对Eb-28活菌数的影响26
3.2.3 pH值对Eb-28活菌数的影响26-27
3.2.4 培养时间对Eb-28活菌数的影响27
3.2.5 菌株Eb-28生长曲线测定27-28
3.3 内生细菌Eb-28菌株鉴定结果28-32
3.3.1 菌株形态及培养性状28-29
3.3.2 生理生化特征29-30
3.3.3 16S rDNA序列分析30-31
3.3.4 鉴定结果31-32
3.4 抑菌活性物质的初步研究32-36
3.4.1 内生细菌Eb-28无菌滤液对番茄灰霉病菌的抑菌活性32
3.4.2 抗菌蛋白粗提液的抑菌活性32-33
3.4.3 内生细菌Eb-28菌株粗蛋白热稳定性33-34
3.4.4 内生细菌Eb-28菌株粗蛋白酸碱稳定性34
3.4.5 内生细菌Eb-28菌株粗蛋白对紫外线稳定性34-35
3.4.6 Eb-28菌株纤维素酶活性测定35
3.4.7 Eb-28菌株β-1,3-葡聚糖酶活性测定35
3.4.8 Eb-28菌株蛋白酶活性测定35-36
4 讨论36-40
4.1 番茄灰霉病药剂筛选生测体系36-37
4.2 内生细菌Eb-28菌株的鉴定37
4.3 内生细菌Eb-28菌株的抑菌物质37-38
4.4 内生细菌应用前景分析38-40
5 结论40-41
5.1 番茄灰霉病生测体系40
5.2 内生细菌Eb-28的培养条件40
5.3 内生细菌Eb-28的鉴定40
5.4 内生细菌Eb-28对番茄灰霉病菌的抑菌物质40-41
参考文献41-46
附录 I 试验中所用培养基及试剂46-48
在读期间发表的学术论文48-49
作者简介49-50
致谢50
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