苜蓿作为“牧草之王”，是农牧业发展中不可缺少的牧草之一，但在我国对苜蓿褐斑病抗性的研究仍限于田间病情调查及相应的研究，本研究采用遗传标记技术对苜蓿品种内个体的抗病性差异进行研究，以期为抗褐斑病品种的选育提供理论依据、基础材料和可借鉴的研究方法，进而促进苜蓿产业的形成和发展。本研究于2000年3月至2001年1月在中国农业科学院畜牧研究所进行，供试材料为2个国外苜蓿品种——伊鲁瑰斯、萨兰斯和3个国内品种——沙湾、沙河及泾阳，采用同工酶标记技术和随机扩增多态性DNA标记技术，对品种内在褐斑病抗性上存在差异的单株进行了混合样品的研究。结果表明： （1）研究发现：在接种后的特定时期，从5个苜蓿品种的3种同工酶酶谱中发现抗性和感性个体间存在特异性酶带，即与褐斑病抗性基因连锁的同工酶标记。在多酚氧化酶酶谱中萨兰斯抗性个体出现了一条特异带；在过氧化物酶的酶谱中发现了萨兰斯、沙湾、沙河、泾阳这4个品种内抗病和感病个体间的特异性酶带；在超氧化物歧化酶的酶谱中发现伊鲁瑰斯和沙河品种内抗病单株缺失了一条酶带。总之，通过某一特定酶带的出现或缺失可以区分5个品种内抗病性不同的个体。 （2）尽管同工酶活性的测定对...更多抗病单株的筛选没有明显的作用，仅能从量上体现出三种同工酶的酶活性在抗性和感性个体间存在差异，但从酶活性的变化趋势可知同工酶的产生与其作用的发挥并不总是同时进行的，即一些诱导性防御反应实际上是由于原有蛋白质活化而不是由于新的基因诱导表达，这在一定程度上取决于该同工酶的生理功能。 （3）对原有的3种基因组DNA提取方法加以修改、简化，得到了改进的N2-CTAB法，这一方法是更加适宜苜蓿的DNA提取法。研究中分别用CTAB法、SDS法、N2-SDS法和新改进的N2-CTAB法提取基因组DNA，从基因组DNA电泳结果、紫外吸收检测和随机扩增基因组DNA 3个方面比较4种不同 的提取方法，认为改进的N；－CTAB法为盲蒲基因组DNA的最佳提取法。该 方法的新颖之处在于增加了液氮速冻叶片组织这一步，而省略了RNA降解过 程，不仅简化了提取步骤，提高了DNA的产量，还扩增出了清晰、多态性丰 富的产物。该方法未见报道。 （4）通过比较7个因素的RAPD扩增结果，获得了理想的首落RAPD反应．体系和反应条件。由于RAPD对反应体系要求比较严格，扩增反应中各种成 分的变化都可能影响扩增结果。因此对影响MPD反应结果的主要因素：模 ．板、引物、twr＊ ug。＼ TN owx聚合酶、预变性时间和退火温度等进行梯 度设置，考察随机扩增结果，得到最佳的反应体系和条件。采用这种方法，能 够扩增出多态性丰富、带型清晰稳定的图谱。 o）运用改进的N丁CTAB法提取基因组DNA，采用上述RAPD反应体系， 经过 3～5次的重复扩增，从 160个 10碱基随机引物中筛选出门个比较理想 的引物，它们的扩增产物中出现了稳定存在的特异性DNA带，通过这些特异 带可以鉴别出5个首淆品种内抗病和感病个体。这＊个引物是：CZ、Cll、 C13、DZ、D7、E19、FI、G6、G13、NS、N15，它们的特异性扩增产物主要 分布在 600hp～1000hp之间。运用这些引物及其扩增产物将有助于方便、快速 地在5个品种的子代中筛选出抗性和感性单株，最终为褐斑病抗性品种的选育 提供育种材料。
苜蓿抗褐斑病遗传标记的研究
中文摘要5-7
英文摘要7
引言9-12
第一章 综述12-31
1．1 遗传标记研究的发展12-16
1．1．1 遗传标记的概念及研究概况12-13
1．1．2 分子标记的种类13-16
1．2 同工酶技术的原理、方法及其应用16-21
1．2．1 同工酶技术的原理16-17
1．2．2 同工酶标记的特点17
1．2．3 同工酶标记在植物研究中的应用17-21
1．3 随机扩增多态性DNA技术的原理、方法及其应用21-31
1．3．1 随机扩增多态性DNA技术的原理21-22
1．3．2 随机扩增多态性DNA技术的特点22-24
1．3．3 随机扩增多态性DNA技术的研究方法24-27
1．3．4 随机扩增多态性DNA在植物研究中的应用27-31
第二章 材料与方法31-39
2．1 材料、仪器及试剂31-34
2．1．1 原始材料的获得31
2．1．2 仪器31
2．1．3 缓冲液及主要试剂的配制31-34
2．2 研究方法34-39
2．2．1 同工酶技术的研究方法34-37
2．2．2 随机扩增多态性DNA技术的研究方法37-39
第三章 结果与分析39-56
3．1 同工酶电泳技术的结果与分析39-41
3．1．1 试验结果39
3．1．2 同工酶电泳结果的分析39-41
3．2 同工酶活性测定的结果与分析41-44
3．2．1 酶活性测定结果41
3．2．2 酶活性测定结果的分析41-44
3．3 随机扩增多态性DNA标记技术的结果与分析44-56
3．3．1 基因组DNA提取方法的结果与分析44-47
3．3．2 优选RAPD反应条件的结果与分析47-51
3．3．3 筛选引物及与苜蓿褐斑病抗性基因利连锁的RAPD标记的结果与分析51-56
第四章 讨论与结论56-61
4．1 讨论56-58
4．1．1 关于同工酶标记技术的几点讨论56
4．1．2 关于随机扩增多态性DNA标记技术的几点讨论56-58
4．2 结论58-61
参考文献61-73
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