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LHR及其mRNA在发情周期不同阶段济宁青山羊子宫内的定位和基因表达 |
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哺乳动物生殖活动的调节主要发生在下丘脑-垂体-性腺轴上,垂体远侧部促性腺激素细胞接受下丘脑促性腺激素释放激素信号(GnRH)后分泌生殖调节关键激素FSH和LH,主要作用于卵巢中相应靶细胞膜上的FSHR和LHR这两种G蛋白偶联受体,介导激活胞内cAMP系统,使GTH信号由胞外转移至胞内。近年的研究发现,LHR不仅存在于性腺组织,如卵巢的颗粒细胞及睾丸的支持细胞,在雌性哺乳动物的子宫、输卵管等生殖道中也有分布。同时,LHR基因敲除鼠表现出明显的子宫发育迟缓。这表明生殖道内的LHR在动物的生殖调控过程中也发挥了重要作用。济宁青山羊是我国专用羔皮山羊品种,成熟早,繁殖力高是该品种的重要特征。初产母羊平均产羔率163.1％,一年产两胎或两年产三胎,平均产羔率为293.7％,最多时一胎可产67羔。为进一步研究济宁青山羊高繁殖力的机理,提高山羊规模化生产的性能及生产效率奠定理论和育种实践基础,我们运用免疫组织化学和半定量RT-PCR的方法对LHR及其mRNA在子宫中的分布和基因表达量的变化进行了研究。实验一LHR mRNA在发情周期不同阶段济宁青山羊子宫中表达差异的研究从济宁青山羊子宫组织中提取总...更多RNA,用RT-PCR方法扩增黄体生成素受体(LHR)基因,获得一条286bp的片段,以pGEM-TEasy vector为载体,转化大肠杆菌E.coli DH5α,筛选阳性克隆并测序。采用优化的半定量RT-PCR技术,以山羊的GAPDH为分子内参,比较研究了处于发情周期不同阶段的济宁青山羊的子宫组织中LHR mRNA的表达差异。结果表明:得到的片段为山羊LHR mRNA的部分序列,与GenBank中登录的山羊LHR mRNA(序列号为AF379199)41-326bp序列同源性高达100％。LHR mRNA在整个发情周期的子宫中都有表达。其中,发情期的表达水平最低(0.454±0.06),且与其它时期比较均差异显著(P<0.05),随之在间情期升高至最高值(0.705±0.09),而后在发情前期下降至0.553±0.07。实验二LHR免疫阳性细胞在济宁青山羊子宫中分布规律的免疫组织化学研究本试验以处于发情期和间情期的济宁青山羊为研究对象,应用免疫组织化学SABC的方法,探讨LHR在其子宫内的形态特点和分布规律。结果表明,LHR免疫反应阳性物质主要存在于子宫的固有层基质细胞和子宫腺的上皮细胞中,子宫肌层LHR免疫阳性物质着色浅或基本没有。在子宫阜中也发现LHR免疫阳性细胞的存在。LHR免疫阳性细胞呈圆形或卵圆形,散在或聚集分布,部分细胞有双核。发情期和间情期的济宁青山羊子宫LHR免疫阳性细胞数量存在差异,其中子宫腺上皮内的LHR免疫阳性细胞间情期数量较多,但与发情期比较差异不显著(P>0.05);在间情期,子宫内膜固有层免疫阳性细胞数量多,且与发情期比较存在显著差异(P<0.05)。
LHR及其mRNA在发情周期不同阶段济宁青山羊子宫内的定位和基因表达
中文摘要8-10
英文摘要10-11
引言12-25
1 黄体生成素的结构和功能13-15
1.1 黄体生成素的结构13
1.2 血浆中LH 分泌特点13-14
1.3 黄体生成素与羊繁殖性能的关系14
1.4 LH 对机体的调控14-15
2 黄体生成素受体的结构和功能15-22
2.1 LHR 的结构16
2.2 LHR 的信号转导16-17
2.3 LHR 的基因17-18
2.4 LHR 在卵巢的分布及作用18-19
2.5 LHR 在子宫中的分布和调控19-21
2.6 LHR 与前列腺素的关系21-22
3 子宫的组织结构和生理作用22-23
3.1 子宫的组织结构22-23
3.2 子宫的主要功能23
4 半定量RT-PCR 方法23-25
实验一 LHR mRNA 在发情周期不同阶段济宁青山羊子宫内表达差异的研究25-45
1 材料与方法25-38
1.1 试验材料25-28
1.2 试验方法28-35
1.2.1 总RNA 的提取28-29
1.2.2 RNA 质量的鉴定29
1.2.3 引物设计及RT-PCR 扩增29-31
1.2.4 LHR 基因的克隆及鉴定31-35
1.3 半定量RT-PCR 体系的建立35-37
1.3.1 引物设计和选择35
1.3.2 PCR 扩增条件的建立35-36
1.3.3 最佳循环次数的确定36-37
1.3.4 最佳Mg~(2+)浓度的确定37
1.3.5 琼脂糖凝胶电泳检测37
1.4 RT-PCR 法对LHR 基因表达差异的检测37
1.5 试验数据的统计分析37-38
2 结果与分析38-42
3 讨论42-44
4 结论44-45
实验二 LHR免疫阳性细胞在济宁青山羊子宫中分布规律的免疫组化研究45-51
1 材料和方法45-48
1.1 试验材料45-46
1.2 试验方法46-48
2 结果48-49
2.1 子宫中LHR 免疫阳性细胞的形态和分布48
2.2 发情期和间情期子宫中LHR 免疫阳性细胞的数量变化48-49
3 讨论49-50
4 结论50-51
参考文献51-62
附录62-64
致谢64-65
作者简介65
硕士期间论文发表情况65
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